一、實驗概述及試劑準備

細胞免疫熒光實驗通過特異性抗體與細胞內相應抗原結合十分落實，再利用熒光標記的二抗進行檢測積極回應，從而實現(xiàn)對細胞內蛋白的可視化更默契了。這一技術在細胞結構與

功能研究不久前、疾病機制探索等方面具有重要應用。

1. 抗體選擇

一抗需特異性識別目標蛋白性能，熒光二抗則要與一抗來源動物種屬相匹配建設項目。例如，如果一抗是小鼠來源生產製造，二抗需是抗小鼠的熒光抗體開展試點。

2. 固定劑與破膜劑

4% 多聚甲醛用于固定細胞，保持細胞結構共同。曲拉通（破膜劑）用于通透細胞膜推進一步，使抗體能夠進入細胞內與抗原結合，但對于膜蛋白染色則可能不需要

此步驟簡單化。

3. 封閉試劑

BSA（牛血清白蛋白）或二抗來源動物的血清（如山羊血清）用于封閉非特異性結合位點力度，減少背景熒光。

4. 其他試劑

PBS 用于清洗細胞系統性，DAPI 用于染細胞核勇探新路，抗熒光淬滅封片劑用于封片并防止熒光淬滅，可選用含 DAPI 的封片劑簡化操作便利性。

5.玻片選擇

-貼壁細胞：可使用蓋玻片或專用細胞爬片方法，還有共聚焦小皿可供選擇。不同規(guī)格的共聚焦培養(yǎng)皿（如圓形的 φ24mm提供有力支撐、φ20mm切實把製度、φ14mm、φ8mm）分別對應不

同孔板配套用細胞爬片自行開發。

-懸浮細胞：直接使用靶點科技懸浮細胞免疫熒光專用玻片（Biotarget）進行部署。不要再用傳統(tǒng)的方法，否則掉片不可避免自動化裝置。

二示範、細胞爬片準備及操作

1.爬片處理（非共聚焦小皿）

將剪裁好的爬片或購買的成品爬片應用前景，置于濃硫酸中浸泡過夜，然后用自來水沖洗干凈運行好。接著將其置于消毒飯盒中首次，飯盒底面放紗布，玻片斜靠在飯盒側

壁且正面不接觸紗布部署安排，進行高壓蒸汽滅菌后烘干搖籃。

對于原代細胞或貼壁不牢的細胞，爬片前最好用多聚賴氨酸推廣開來、層粘蛋白或膠原溶液處理玻片以增加細胞粘附性推動，處理后用培養(yǎng)基沖洗 1 - 3 遍再放入培

養(yǎng)基中。

2.共聚焦小皿

無需前處理操作資源配置，直接在超凈臺打開包裝信息，加入細胞懸液，蓋上皿蓋大力發展，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可豐富內涵。

三、實驗操作

1.細胞接種準備

胰酶消化細胞后計數(shù)不同需求，重懸細胞于培養(yǎng)基中發展。根據(jù)玻片大小保持穩定，在每個孔里放爬片的位置先滴 100ul 培養(yǎng)基總之，使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基張力粘合，然后放

玻片支撐作用，防止加細胞懸液時玻片漂起研學體驗。

2.細胞接種

根據(jù)實驗需要及細胞生長情況選擇合適的細胞密度接入培養(yǎng)板內。待細胞貼壁后最為突出，可去上清加含藥培養(yǎng)基落實落細。

3.玻片取出

按照實驗設計，作用一定時間后取玻片（通常作用 24h）高效化。取玻片時製高點項目，可將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，輕輕勾起爬片範圍和領域，用小鑷子取出有所增加。對于多時

間點實驗，取出所需數(shù)量的爬片時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子特征更加明顯，未取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)估算。

四、固定的可能性、通透及封閉步驟

1.清洗與固定方式

可以將爬片取出用 PBS 清洗后固定不要畏懼，也可以直接在孔板中清洗并固定服務為一體。共聚焦小皿則直接移除培養(yǎng)基，加入 PBS 清洗 1 - 3 次（不可劇烈搖晃）逐漸顯現，然后

加入 4% 多聚甲醛進行固定全會精神，通常在室溫（RT）固定 15 - 20min。

2.通透及封閉劑選擇與作用條件

如果抗體針對胞內蛋白拓展基地，則需要通透步驟先進技術。常用的透化劑是 0.1% Triton X - 100（將 100% 的成品用 PBS 稀釋），作用 10min不合理波動，但文獻中也有用 0.2% 或 0.5% Triton X - 100 的宣講手段，具體可根據(jù)預實驗進行調整。

BSA 濃度為 1% 或 5%（用 PBS 溶解）積極拓展新的領域，血清濃度為 10%配套設備，在室溫（RT）封閉 30min。如果一抗結合力很強或二抗有非特異性結合相對開放，可添加 0.1% Tween20推進高水平。

五、抗體孵育及染色封片

1.一抗稀釋與孵育條件

封閉結束后拓展應用，用 PBS 清洗 3 遍生產創效，然后孵育一抗。一抗可用封閉液稀釋管理，也可以用 PBS 或抗體稀釋液優化上下，在 4℃孵育過夜。一抗稀釋比例可參照抗體說明書模樣，建議從推薦比例中間開始試生產體系。

2.二抗孵育操作

次日吸走一抗（可回收）后，用 PBST 清洗 3 遍很重要，每次 5 - 10min能力和水平，然后避光孵育二抗 1h。

3.DAPI 染色操作

去除二抗異常狀況，用 PBS 清洗三次國際要求，加入 DAPI，室溫靜置 5min鍛造，去除 DAPI競爭激烈，再用 PBS 洗 3 次。

4.封片操作

向載玻片上加入一滴封片劑逐漸完善，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上參與能力，細胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑是目前主流。

免疫熒光充分發揮，其實各種Protocol大同小異高質量，核心除了多聯(lián)系，還要多思考選擇適用。弄懂背后的邏輯管理。不能機械的做。